质粒提取秘籍，你Get到了吗？
质粒是基因工程中最常用(yòng)的载體(tǐ)工具，方便目的DNA片段的插入整合进而获得重组质粒，然后导入宿主细胞，最后利用(yòng)质粒上的功能(néng)元件，实现目的DNA片段的复制、转录以及相应蛋白的表达。
除了在科(kē)研领域的普遍应用(yòng)，重组质粒已广泛应用(yòng)在多(duō)类生物(wù)医药产品研发生产中，例如重组蛋白药物(wù)、质粒DNA疫苗、基因治疗药物(wù)以及CAR-T药物(wù)等。目前，质粒已是基因工程实施过程中的一个基础工具。
高品质质粒的获得是下游各项实验成功的重要保障。质粒提取主要包括三个基本步骤：质粒DNA在菌體(tǐ)细胞内的扩繁、质粒DNA从菌體(tǐ)细胞中的裂解释放和裂解液中游离质粒DNA的分(fēn)离与纯化。碱裂解法是最常用(yòng)的质粒DNA提取方法，根据共价闭合环状质粒DNA与線(xiàn)性基因组DNA的拓扑學(xué)结构差异导致的变性-复性速率不同进行分(fēn)离，具有(yǒu)得率高，适用(yòng)广，提取快速等特点。
质粒提取之后，可(kě)以使用(yòng)多(duō)种方法评价提取的质量。一般评价质粒提取效果的指标包括得率、纯度和超螺旋质粒比例和内毒素含量。紫外分(fēn)光光度法一般用(yòng)于测定质粒得率和纯度，当测值OD260/280=1.7-1.9、OD260/230>2时表示质粒纯度较好；同时，结合琼脂糖凝胶電(diàn)泳法观察质粒样品在凝胶中带型、大小(xiǎo)和亮度，可(kě)以判断浓度、超螺旋质粒比例和纯度（主要是基因组DNA、RNA和蛋白等残留）。质粒样本在琼脂糖凝胶中的最理(lǐ)想状态是呈现单一的超螺旋条带，但多(duō)数情况是会呈现2条或3条带。这是由质粒的不同构型在凝胶電(diàn)泳中的泳动速率不同造成的，超螺旋质粒跑的最快，其条带越亮表明质粒完整性越好。在对质粒DNA纯度要求高的应用(yòng)场景中，内毒素水平也是一个非常重要的指标。内毒素含量测定通常采用(yòng)金标准的鲎试剂法定量检测，当内毒素含量低于0.1EU / µg 时，通常被认為(wèi)是无内毒素质粒。
那么，如何提取到高质量的质粒、提高下游实验的成功率呢(ne)？经验表明，质粒质量受多(duō)种因素影响，除了试剂盒本身性能(néng)外，也与宿主菌株，培养基类型，培养条件，质粒类型，质粒大小(xiǎo)和拷贝数等有(yǒu)关。
菌株类型
用(yòng)于提取质粒的宿主菌大多(duō)数是大肠杆菌，而菌株类型往往会对质粒 DNA的提取质量产生较大影响。DH5α 和XL1-Blue是较為(wèi)常用(yòng)的宿主菌株，转化效率较高，质粒产量较大，通常可(kě)以满足高质量质粒 DNA的制备。其他(tā)菌株如 HB101，裂解时则会释放大量的糖类代謝(xiè)物(wù)，如果残留较多(duō)，会抑制后续的酶促反应，进而对提取的质粒 DNA质量带来不利影响。此外，含有(yǒu)较高内切酶活性的宿主菌株，会降低质粒DNA得率。因此，宿主菌株的类型需要根据具體(tǐ)用(yòng)途来做出选择。
质粒类型
质粒的大小(xiǎo)和拷贝数均一定程度影响质粒得率。通常来讲，质粒越大或插入的DNA片段越大，质粒DNA产量越低。细菌中质粒的拷贝数主要决定于质粒本身的复制特性。对于低拷贝质粒，菌液量往往需要更多(duō)才能(néng)获得较高的质粒浓度。而且，部分(fēn)细菌菌株内，可(kě)以选择在培养阶段加入氯霉素，以提高宿主细胞的质粒产量。
菌液投入量
由于菌體(tǐ)生長(cháng)的营养类型，生長(cháng)条件（振荡速度、温度、时间），宿主菌株或质粒插入类型等的影响，细菌培养的最终细胞浓度变化范围极大。根据经验值，OD600為(wèi)1的1升大肠杆菌培养液包含1×1012个细胞，细胞湿重约為(wèi)1.5-1.8g。由于菌液體(tǐ)积不能(néng)反映出细菌细胞浓度与重量，而细胞重量的测定具有(yǒu)一定局限性，所以采用(yòng)两个便于测量的变量值的乘积作為(wèi)提取质粒前确定菌量的标准（ODV=菌液吸光值OD600×菌液體(tǐ)积V）。以济凡质粒大提试剂盒為(wèi)例，测试菌液样本的ODV值与质粒得率的相关性，结果表明，质粒DNA得率与投入菌量显著相关。菌體(tǐ)投入量过多(duō)易导致菌體(tǐ)裂解不充分(fēn)，质粒得率下降。因此，选择适当的菌液量是提高质粒得率的关键因素。
菌體(tǐ)培养条件
对于含常规的高拷贝质粒宿主菌的培养，推荐使用(yòng) LB (Luria-Bertani) 培养基。為(wèi)了使细菌生長(cháng)获得最佳条件，可(kě)使用(yòng)至少3倍培养基體(tǐ)积的三角瓶培养细菌，以提供充足的氧饱和环境。2 x YT、TB (Terrific Broth)等富营养培养基也可(kě)选择用(yòng)于高拷贝质粒宿主菌的培养。此外，当宿主菌株接种到培养基中时必须加入抗生素进行筛选培养。摇床的摇晃速度、温度和时间等都会对细菌生長(cháng)产生重要影响。菌體(tǐ)振荡培养时间不应过長(cháng)，过度生長(cháng)会使菌體(tǐ)细胞死亡裂解，导致质粒 DNA丢失或变异。為(wèi)了提取高质量的质粒，需要找到细菌扩增繁殖的最优条件。
内毒素去除
内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁上存在的一类脂多(duō)糖物(wù)质的总称，单位用(yòng)EU表示。内毒素在细菌细胞生長(cháng)过程中会有(yǒu)少量内毒素释放，当细胞大量死亡或裂解时会释放出大量内毒素。游离的内毒素分(fēn)子会激活哺乳动物(wù)免疫系统产生炎症反应。因此，对于内毒素敏感细胞转染实验或动物(wù)活體(tǐ)实验，需要在制备质粒时尽可(kě)能(néng)清除内毒素，以保证较高的细胞转染效率和排除内毒素对活體(tǐ)实验的干扰。根据实验需求的不同，选择相对应的质粒提取试剂盒可(kě)事半功倍。济凡质粒大提试剂盒，引入了可(kě)选择的内毒素清除步骤，以满足不同的质粒应用(yòng)场景。对于内毒素非敏感细胞，可(kě)直接省掉内毒素清除步骤；而对于内毒素敏感细胞，可(kě)选择加入内毒素清除步骤，一盒两用(yòng)，简单方便。
提取与纯化操作
裂解细菌细胞并释放质粒的方法有(yǒu)很(hěn)多(duō)，如煮沸法，梯度离心法、碱裂解法等。由于碱裂解法操作简单，且处理(lǐ)方式温和，市面上应用(yòng)较多(duō)。要获得高质量质粒DNA，一定不能(néng)忽略菌體(tǐ)裂解步骤，在加入SDS-NaOH后不要剧烈震荡，容易导致质粒DNA断裂，影响完整性，且易混入小(xiǎo)片段基因组DNA，影响质粒纯度。纯化质粒目前已发展出多(duō)种方法，如盐析法、硅胶介质吸附法，阴离子交换树脂法等，盐析法一般涉及有(yǒu)毒试剂，操作并不友好。阴离子交换树脂法获得的质粒得率和纯度都较好，但成本较高。使用(yòng)比较广泛的是硅胶介质吸附法，该方法制备的质粒得率、纯度都较优，成本也相对较低，可(kě)满足大部分(fēn)客户需求。质粒纯化时需要考虑不同产品中吸附柱对质粒DNA的吸附能(néng)力，若样本质粒量很(hěn)大，可(kě)分(fēn)多(duō)次分(fēn)离纯化。漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液體(tǐ)，确保质粒中无乙醇残留。济凡质粒提取试剂盒具有(yǒu)较优的菌體(tǐ)裂解性能(néng)和质粒纯化性能(néng)。
保存方法
提取后的质粒除了本身质量外，也应注意提供适宜的保存环境，以防止质粒降解影响下游应用(yòng)，一般质粒可(kě)保存于TE溶液中，在4℃短期保存，在-80℃或-20℃中長(cháng)期保存。除了直接保存质粒，还应将含质粒的宿主菌保存于甘油中，-80℃或液氮中可(kě)長(cháng)期保存。
当然，除了以上介绍的操作要点之外，一款操作方便、提取效率高的试剂也是必不可(kě)少的。济凡生物(wù)是一家集研发、生产、销售和技术服務(wù)為(wèi)一體(tǐ)的國(guó)家高新(xīn)生物(wù)技术企业，致力于為(wèi)科(kē)研、工业医疗以及生物(wù)医药领域提供稳定可(kě)靠、高性价比的产品解决方案和专业技术服務(wù)。济凡质粒大提试剂盒经研发精心设计优化，可(kě)以大幅提高质粒提取质量，解决客户实验中可(kě)能(néng)遇到的得率低，纯度低，内毒素高等问题，是当之无愧的实验好帮手。
FinePure无内毒素质粒大提试剂盒（升级版）
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得率高、纯度好：独特的玻璃纤维素膜吸附技术，高效专一结合质粒DNA；
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内毒素清除步骤灵活：含内毒素清除Buffer，根据下游不同需求可(kě)选择性加入或去掉该步骤，操作简单方便，适用(yòng)范围广；
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时间短：整个提取过程50min左右；
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应用(yòng)广：提取的质粒可(kě)满足下游克隆、酶切、测序和细胞转染等实验
