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干货分(fēn)享 | 新(xīn)冠病毒核酸rRT-PCR分(fēn)析注意事项

题目：rRT-PCR for SARS-CoV-2: Analytical considerations
期刊：Clinica Chimica Acta 516（2021）1-7
通讯作者：Mohammad Abdi
DOI号：10.1016/j.cca.2021.01.011
编译：俞萍
 

一、背景介绍

新(xīn)冠疫情仍然是全世界卫生系统面临的一个重大问题。早期准确检测新(xīn)冠病毒感染对于最大限度地减少传播和治疗至关重要。在检测方法中，实时逆转录聚合酶链式反应(rRT-PCR)被认為(wèi)是金标准。
 
该检测方法具有(yǒu)较高的特异性和灵敏性，但对于有(yǒu)症状的或CT扫描呈阳性的患者中出现假阴性结果来说仍然是一个挑战。误差来源可(kě)能(néng)是分(fēn)析前(采样、储存和处理(lǐ))、分(fēn)析中(RNA提取、cDNA合成和扩增)和分(fēn)析后(解释和分(fēn)析)。文(wén)章总结了这些潜在的误差来源和减少误差的措施。
 

二、分(fēn)析前误差

分(fēn)析前最重要的误差来源之一发生在取样步骤中。其中最关键的是正确的采样位置，包括鼻子、喉咙和气管导管等，要使用(yòng)标准采样耗材（尼龙植绒而非棉签）进行采样，拭子应在适当位置保持10秒(miǎo)并旋转三次。采样过程中，如果拭子被手套粉末、喉咙末端的食物(wù)碎屑等污染物(wù)浸透，会对结果的准确性产生不利影响。
 
取样后将这些误差降至最低的方法是将拭子快速转移到合适的运输介质中，并快速送到实验室，同时控制运输温度（2–8℃）和时间（72小(xiǎo)时内）。图片不正确的取样和储存可(kě)能(néng)是产生错误结果的重要来源，特别是在病毒载量低的样本中。多(duō)项研究表明，在疾病的早期阶段，病毒大多(duō)位于鼻部，因此在此期间从喉咙中采样更可(kě)能(néng)是假阴性，建议在症状出现后5或6天采集鼻咽和口咽拭子。
 

三、分(fēn)析中误差

分(fēn)析中重要误差可(kě)能(néng)发生在核酸提取步骤中，对所提取RNA的数量和质量有(yǒu)很(hěn)大影响。核酸提取过程中的主要污染蛋白是核酸结合蛋白，它可(kě)以干扰cDNA合成反应，特别是PCR过程。选择合适的RNA提取方法是获得有(yǒu)效结果的关键步骤，自动化磁珠法核酸提取被认為(wèi)是最安全和最快的方法，这种方法只需要很(hěn)少的人工干预。
 
内源性和外源性核糖核酸酶降解RNA也可(kě)能(néng)影响提取RNA的质量和数量，并导致假阴性结果。最终洗脱的核糖核酸应溶于不含RNA酶的水中，以防止RNA降解导致假阴性结果。核酸提取过程中有(yǒu)几种试剂会降低PCR效率，如手套粉末、盐、去污剂以及苯酚和乙醇等有(yǒu)机分(fēn)子，因此在RNA提取过程中应避免使用(yòng)或尽量减少使用(yòng)。此外，避免提取的核酸暴露于紫外線(xiàn)照射也很(hěn)重要。同时為(wèi)了避免分(fēn)子实验室环境受到气溶胶的影响，需要分(fēn)區(qū)域实验。
 
cDNA合成和扩增中引物(wù)和探针的储存也是重要因素，反复冻融和長(cháng)时间的光暴露降低了稳定性和反应效率。准确移取RNA和酶在cDNA合成过程中起主要作用(yòng)，移液方法和移液器应该都是校验过的。在一步法的RNA逆转录和cDNA扩增中，对于RNA水平较低的样本，扩增效率低导致错误分(fēn)析时有(yǒu)发生。高浓度的逆转录酶对扩增有(yǒu)抑制作用(yòng)。
 
PCR仪校准发生故障也有(yǒu)可(kě)能(néng)导致不准确的扩增温度和循环时间。新(xīn)冠病毒rRT-PCR检测中最重要的挑战之一是选择效率最高的引物(wù)，已证实ORF1ab、N和RdRp引物(wù)比其他(tā)引物(wù)具有(yǒu)更高的敏感性、特异性和阳性预测价值。病毒基因组发生突变和重组，使得新(xīn)冠肺炎检测相当困难。為(wèi)了提高方法的灵敏度并克服这一问题，应更多(duō)地考虑引物(wù)浓度、引物(wù)退火和设计用(yòng)于多(duō)靶点检测的引物(wù)，在筛选扩增程序中应考虑使用(yòng)不同引物(wù)的组合策略来提高检测能(néng)力。
 
通过常用(yòng)rRT-PCR方法产生假阴性结果的最重要原因之一是病毒载量低导致，研究表明数字PCR在检测低病毒载量样本方面比rRT- qPCR具有(yǒu)更高的灵敏度和特异性。
 

四、分(fēn)析后误差

新(xīn)冠肺炎检测相关的分(fēn)析后误差并不是很(hěn)多(duō)。最常见的误差来源之一是操作员对数据的错误解读。通过基線(xiàn)、阈值和扩增曲線(xiàn)绘制精确的图表，并确保检测灵敏度，可(kě)以大大降低这些错误解读的可(kě)能(néng)性。频繁冻融标准溶液也会增加CT值，所以标准溶液应避免反复冻融影响结果判读。
 
扩增曲線(xiàn)对于确定基線(xiàn)和阈值循环很(hěn)重要，新(xīn)冠肺炎阳性的rRT-PCR结果的CT值应小(xiǎo)于40，大于40的结果应视為(wèi)阴性结果。CT值為(wèi)37–40的样本必须重新(xīn)取样检测。
 
对内标无扩增首先分(fēn)析PCR过程是否有(yǒu)问题。如果PCR重复结果还是如此，则需要重新(xīn)取样检测。实时PCR是一种非常灵敏的方法，因此移液、组分(fēn)质量、设备校准和温度等都可(kě)能(néng)会导致结果不稳定和不准确。因此，使用(yòng)内标可(kě)以提高PCR过程的准确性。
 
实时逆转录聚合酶链反应的效率是一个关键因素。最佳效率為(wèi)90 ~ 110%，最佳扩增效率是获得准确PCR结果的必要条件，在进行数据分(fēn)析之前应予以考虑。
 

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五、结论

文(wén)章总结分(fēn)析了假阴性或假阳性结果的一些可(kě)能(néng)来源。分(fēn)析前误差被认為(wèi)是新(xīn)冠肺炎诊断中的主要可(kě)能(néng)误差来源，包括采样耗材、采样位置和采样时间。在分(fēn)析阶段，RNA提取是主要关注点，其数量和质量是重要因素。同时通过引物(wù)设计、储存条件、PCR组分(fēn)和移液器校准来优化rRT-PCR过程，如果病毒基因组发生突变，则应优化新(xīn)的引物(wù)。
 
在分(fēn)析后阶段，必须使用(yòng)各种阳性和阴性对照品来确认和解释结果。因此，使用(yòng)质控品对每次检测都至关重要，同时分(fēn)析解释数据的人员应该具有(yǒu)专业知识和能(néng)力。