关于血液基因组提取，你应该知道的事
背景：随着分(fēn)子生物(wù)學(xué)技术的发展，基因组水平上的研究已成為(wèi)热点。在分(fēn)子遗传學(xué)和分(fēn)子流行病學(xué)中，无论是全基因组关联分(fēn)析GWAS（Genome-Wide Association Studies）、候选SNP（Single Nucleotide Polymorphism）位点基因分(fēn)型，还是基因组文(wén)库的建立，都需要从大批量血液样本中提取基因组DNA。因此，如何能(néng)够从血液样本中提取高质量、高纯度的DNA成為(wèi)下游试验中最关键的一步。
為(wèi)了更好的获得高质量、高纯度的DNA，那么我们首先应该了解血液的组成是什么？
图源：
https://www.khanacademy.org/science/biology/humanbiology/circulatorypulmonary/a/components-of-the-blood
1.血液的组成
血液是动物(wù)體(tǐ)内的一种體(tǐ)液，可(kě)向细胞输送必要的物(wù)质，如营养和氧气，并将代謝(xiè)废物(wù)从这些细胞中运走。血液的成分(fēn)包括血浆（液體(tǐ)部分(fēn)，含有(yǒu)水、蛋白质、盐、脂质和葡萄糖）、红细胞、白细胞和血小(xiǎo)板。
图源：
https://courses.lumenlearning.com/boundless-biology/chapter/components-of-the-blood/
人體(tǐ)血液的细胞和细胞成分(fēn)：红细胞向细胞输送氧气并去除二氧化碳。白细胞（包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞）参与免疫反应。血小(xiǎo)板形成凝块，防止受伤后失血。
a、血浆：
血浆是去除所有(yǒu)细胞和血小(xiǎo)板后的血液液體(tǐ)成分(fēn)，约占总血量的 55%。血浆由 90% 的水和抗體(tǐ)、凝血因子以及维持身體(tǐ)所需的電(diàn)解质、脂质和蛋白质组成。
b、红细胞：
红细胞（Red blood cells或erythrocytes，erythro- = “红色”；-cyte = “细胞”）是一种通过身體(tǐ)循环向其他(tā)细胞输送氧气的特殊细胞，由骨髓中的干细胞形成，约占总血量的 45%。在哺乳动物(wù)中，红细胞是小(xiǎo)的双凹细胞，成熟时不含细胞核或線(xiàn)粒體(tǐ)。它们的大小(xiǎo)只有(yǒu) 7–8 µm。在鸟类和非鸟类爬行动物(wù)中，红细胞含有(yǒu)一个细胞核。
图源：NHLBI (public domain)
红细胞的颜色来自含铁蛋白质血红蛋白，在大多(duō)数哺乳动物(wù)中，红细胞没有(yǒu)任何细胞器（例如细胞核、線(xiàn)粒體(tǐ)）。无脊椎动物(wù)使用(yòng)不同的色素来结合和携带氧气。例如血蓝蛋白（一种蓝绿色、含铜的蛋白质）、氯红素（一种绿色、含铁的色素）和蚯蚓血红蛋白（一种红色、含铁的蛋白质）。
图源：
https://courses.lumenlearning.com/boundless-biology/chapter/components-of-the-blood/
- 血红蛋白 b. 血蓝蛋白 c. 蚯蚓血红蛋白
c.白细胞：
白细胞（White blood cells或 leukocytes，leuko = 白色）约占总血量不到 1%。白细胞的作用(yòng)与红细胞的作用(yòng)非常不同。它们主要参与识别和靶向病原體(tǐ)的免疫反应，例如入侵的细菌、病毒和其他(tā)外来生物(wù)。
图源：
https://courses.lumenlearning.com/boundless-biology/chapter/components-of-the-blood/
白细胞的类型：(a) 粒性细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞）的特征在于细胞质中的叶状核和粒状包涵體(tǐ)。粒细胞通常是受伤或感染期间的第一反应者。(b) 无粒细胞包括单核细胞和淋巴细胞。单核细胞分(fēn)化成巨噬细胞和树突状细胞，进而对感染或损伤作出反应。淋巴细胞，包括 B 细胞和 T 细胞，负责适应性免疫反应。
d.血小(xiǎo)板：
血小(xiǎo)板是由称為(wèi)巨核细胞的较大细胞分(fēn)解形成的。对于每个巨核细胞，形成 2000-3000 个血小(xiǎo)板，每立方毫米血液中存在 150,000 至 400,000 个血小(xiǎo)板。每个血小(xiǎo)板呈圆盘状，直径為(wèi) 2-4 μm，它们包含许多(duō)小(xiǎo)囊泡，但不包含细胞核。
(a) 血小(xiǎo)板是由称為(wèi)巨核细胞的大细胞形成的。巨核细胞分(fēn)裂成数千个碎片，成為(wèi)血小(xiǎo)板。(b) 血小(xiǎo)板与其他(tā)凝血因子（例如纤维蛋白原）一起聚集在伤口部位，形成纤维蛋白凝块，防止失血并使伤口愈合。
2.血液基因组提取方法
a.盐析方法:
经典盐析法提取血液DNA，其方法為(wèi)溶解红细胞后，离心沉渣用(yòng)PK消化，用(yòng)大约6M饱和NaCl沉淀蛋白质，离心上清中DNA用(yòng)无水乙醇沉淀，用(yòng)TE溶解。此方法提取的DNA质量尚可(kě)，但产率较低，并且纯度较差。
b.有(yǒu)机溶剂方法:
有(yǒu)机法提取DNA一般是指用(yòng)平衡酚(又(yòu)叫饱和酚)、氯仿等按不同比例混合，采用(yòng)不同方法提取DNA。此方法操作繁琐，耗时久，且所用(yòng)试剂具有(yǒu)一定的毒性。
c.柱法（硅膜法）：
特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA（低盐、高pH值情况下释放DNA），配备设计独特的离心吸附柱式结构，使用(yòng)常规台式高速离心机，在30-60min之内即可(kě)以高效回收核酸片段。此方法操作简便，但依赖人工操作，很(hěn)难实现自动化。
d.磁珠法：
异硫氰酸胍是强烈蛋白变性剂，不破坏蛋白质一级结构，能(néng)破坏细胞膜及核膜蛋白，并使核酸酶失活，释放DNA。磁珠可(kě)以特异性吸附DNA，通过洗涤液洗涤，在仅留有(yǒu)特异吸附DNA的磁珠中加入洗脱液，DNA释放于洗脱液中。此方法自动化程度高，可(kě)满足高通量提取的需求，是未来核酸提取的发展方向。
3.济凡磁珠法大體(tǐ)积血液核酸提取
近些年，随着医院和第三方独立医學(xué)实验室等医疗机构建立DNA样本库的需求越来越广泛，1～4mL大體(tǐ)积全血DNA提取的工作量迅速增加，传统的手工操作已经不能(néng)满足建立DNA样本库的要求，采用(yòng)自动化工作站进行大體(tǐ)积全血DNA的快速提取已经成為(wèi)大势所趋。
目前市面上大體(tǐ)积全血DNA提取多(duō)采用(yòng)裂解红细胞前处理(lǐ)、吸附柱等方法从全血中提取DNA，这些方法具有(yǒu)操作繁琐、通量小(xiǎo)、耗时等特点。济凡生物(wù)正在研发的新(xīn)型核酸提取试剂，可(kě)搭配24通道自动核酸提取仪进行大體(tǐ)积血液核酸提取。无需裂红前处理(lǐ)，机上裂解，一次可(kě)提取24个样本，整个过程在2h内完成。
图：济凡24通道核酸自动提取仪（适配大體(tǐ)积血液提取）
示例：济凡磁珠法大體(tǐ)积血液提取2 mL全血（300 μL 洗脱）
由以上结果可(kě)以看出：济凡磁珠法大體(tǐ)积血液提取2 mL全血，DNA得率在70-78 μg之间，A260/A280在1.8-2.0左右，A260/A230在1.8-2.0左右。
参考文(wén)献：
1.Components of the Blood
https://courses.lumenlearning.com/boundless-biology/chapter/components-of-the-blood/
2.Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res. 1988 Feb 11;16(3):1215. doi: 10.1093/nar/16.3.1215. PMID: 3344216; PMCID: PMC334765.
3.Buedts L, Smits S, Ameye G, Lehnert S, Ding J, Delforge M, Vermeesch J, Boeckx N, Tousseyn T, Michaux L, Vandenberghe P, Dewaele B. Ultra-low depth sequencing of plasma cell DNA for the detection of copy number aberrations in multiple myeloma. Genes Chromosomes Cancer. 2020 Aug;59(8):465-471. doi: 10.1002/gcc.22848. Epub 2020 May 5. PMID: 32259320.
